本期《精准前沿》栏目分享美国MSK癌症研究中心研究团队发表在Nature Communications（IF=17.694）上的一篇研究[1]，研究开发了一种名为Pointy的方法，该方法能够从低覆盖度血浆WGS（深度0.3-1.5x）测序数据中分析全基因组的突变特征，通过对样本进行单碱基替换（SBS）的特征分析，并结合机器学习的方法进行癌症检测。

研究背景

液体活检技术在癌症无创早期筛查、预后及治疗监测中的应用越来越广泛。癌症样本的血浆样品中循环肿瘤DNA（ctDNA）的相关特征，包括点突变、拷贝数变异及甲基化模式等，可以反应癌症的病理及类型；血浆中的其它特征可能与游离DNA（cfDNA）有关，包括cfDNA片段长度，片段碎裂模式，核小体印迹等，可以反应癌症细胞的生物学特性；这些特征都可用于癌症的早期检测。

突变事件在个体整个生命周期过程中是不断累积的。体细胞基因组中突变事件的积累是同时由于内源性过程（如老化）和外源性暴露（如吸烟、紫外线）导致的。由于细胞破裂时会向循环系统中释放cfDNA片段，因此通过对血浆中cfDNA的检测可能反映出体细胞相关的突变特征。传统的体细胞突变特征检测方法中，主要是基于中等深度的WGS测序对癌症和非癌症样本的突变信号进行检测。在低深度的WGS数据中，体细胞和胚系突变仅通过等位基因分数难以进行区分，并且由于测序深度过低以及测序错误等因素，导致基于单个突变位点等位基因分数的检测方法在癌症检测中无效。即使是在高深度的WGS测序条件下，当ctDNA分数过低时，由于肿瘤细胞中低等位基因突变分数的长尾效应，该突变DNA可能只会被检测到一条突变read。

本研究中提出了一种名为Pointy的方法，可以从低覆盖度血浆WGS（LP-WGS）测序数据中分析全基因组的突变特征，对样本进行单碱基替换（SBS）的特征分析，并结合机器学习的方法进行癌症检测。本研究采用各种方法来减轻技术和生物噪音，在癌症和非癌症样本中识别突变特征，使得基于突变特征的早期癌症检测方法成为可能。

研究设计

本研究中采用的队列都来源于已发表的独立数据集，其中PGDX队列作为发现队列，纳入的样本包括：四期结直肠癌患者（n=16）及健康对照样本（n=19），其中癌症患者多数具有错配修复缺陷（MMR-D）和/或微卫星不稳定性（MSI）；DELFI队列作为验证队列，纳入的样本包括：I-IV期NSCLC患者（n=37），I-III期乳腺癌患者（n=48），I-IV期结直肠癌患者（n=27），I、III、IV期卵巢癌患者（n=26），0-IV期胃癌患者（n=27），I-III期胰腺癌患者（n=34）以及206例健康对照样本。

整体研究思路大体可以分为以下4个步骤：

1. 通过常规突变检测流程检测突变，包括：Trimmomatic修剪fastq文件；bwa比对；picard DownsampleSam降采样；samtools mpileup突变检测；仅保留碱基质量 30，比对质量 60，以及R1和R2上同时存在的点突变；进一步过滤SNP，即去除dbsnp数据库中的SNP，本研究中提出假设认为这些SNP主要与衰老特征相关，去除这些SNP后，能提升癌症检测的精度。基于点突变的类型（C A, C G, C T, T A, T C, T G）及紧邻5 和3 的碱基，构成96种三碱基突变特征，分别统计96种突变特征出现的次数。

2. GC校正：由于PCR过程引入的GC偏好，会影响覆盖度的均一性，基于此，需进行GC校正。通过GAM方法对所有样本的GCbias矩阵进行拟合得到每种GC条件下校正后的覆盖度，基于该覆盖度，对每个样本的突变reads进行校正，进而获得每个样本校正后的突变特征值。

3. SBS特征拟合：基于突变特征矩阵以及参考的SBS频率矩阵，通过非负矩阵分解（NMF）方法进行SBS特征的拟合。

4. 机器学习构建癌症分类模型：对校正后的突变特征进行PCA降维，降维后的主成分结合ichorCNA获得的肿瘤纯度构建分类预测模型（xgboost，Random Forest，SVM，Logistic Regression）。

图1. 研究概览及数据描述图

研究结果

1. 在PGDX队列中突变特征的检测

首先，对PGDX队列中四期结直肠癌（CRC）的患者进行分析，这些患者多存在错配修复缺陷及微卫星不稳定性。采用Pointy方法提取突变特征，并拟合SBS特征谱，从图2中可以看出，在CRC患者中贡献最大的特征是SBS1和SBS54，与健康样本相比，差异最显著的特征是SBS1和SBS21。其中，老化特征（SBS1和SBS5）以及MSI特征（SBS20和SBS21）在CRC和健康对照样本中差异显著，在CRC患者中，老化和MSI的贡献相对于健康对照样本贡献更多；且都与ctDNA肿瘤纯度和TMB存在显著的相关性。

图2. IV期结直肠癌患者的突变特征图谱

2.PGDX队列中的分类预测结果

本研究中利用96种三碱基突变特征图谱对PGDX队列构建了分类预测模型。从图3a的主成分分析结果中可以看出，CRC患者和健康人对照样本能基于主成分进行良好的区分，且PC1和PC2与ctDNA肿瘤纯度显著正相关。进一步评估了每种SBS特征对主成分的贡献度，从图c可以看出，SBS3对PC1的贡献度最大，SBS8对PC2的贡献度最大。最后对突变特征的主成分构建随机森林分类预测模型，AUC可达0.99（95%CI：0.95-1）。

图3. PGDX队列的分类检测结果 

3. DELFI队列中的分类预测结果

为进一步验证Pointy方法的性能，将该方法应用于DELFI队列中，使用去除SNP位点的96种突变特征矩阵构建随机森林模型，结果表明对所有癌种中，癌与非癌的分类性能为0.96（95% CI：0.94-0.96）。

图4. 跨癌症类型的癌症检测 

讨论

本研究提出了一种基于LP-WGS全基因组突变特征的癌症检测方法，并探索了不同SBS信号在癌症患者与健康样本中的差异，展示了癌症与健康样本中存在不同的突变过程。

由于测序深度不足，获得的突变特征中并未去除胚系突变，且低频的突变特征可能会被遗漏，限制了该方法检测的灵敏度；本研究中纳入的队列都来源于已发表的研究，后续需要在更大的样本集中进行验证。

结语

本研究基于LP-WGS的全基因组突变特征，结合机器学习对癌症进行检测，并在两个独立的队列中验证的分类性能良好，显示了其在癌症早期筛查中潜在的应用价值。后续可尝试通过深度测序结合胚系突变检测的方法，或与片段组特征结合构建整合模型的方法，探索更优的性能及更多的可能性。

END

参考文献：  [1] Wan, J. C. M. et al. Genome-wide mutational signatures in low-coverage whole genome sequencing of cell-free DNA.Nat Commun 13, 4953 (2022). 

撰写丨吴兮  编辑、排版丨SX